文献分享：m6A调控肿瘤转移 ♂
文献分享：m6A调控肿瘤转移
- 文献分享：m6A调控肿瘤转移
- 肿瘤免疫分型深度剖析好文
- 纯生信分析套路 综述|癌症中m6A与非编码RNA之间相互作用新见解
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文献来源于19年的Nature Communication：RNA m6A methylation regulates the epithelial mesenchymal transition of cancer cells and translation of Snail ，
第一章：肿瘤免疫分型的起源
1.肿瘤免疫分型的由来
肿瘤的近代治疗起源于西方，可从18世纪算起。而更远的肿瘤治疗史可追溯到我国宋代。最早描述癌症的特征是《仁斋直指附遗方论》一书中 “癌者上高下深，岩穴之状，颗颗累垂……毒根深藏，穿孔透里” ，意思是说肿瘤像岩石状，有毒根深藏于体内，从这句话可以看出那时对肿瘤的外观描述，基本上与现在的肿瘤类似。人类与肿瘤的斗争已长达上千年，而始终没有取得重大进展。这是因为先前对肿瘤的研究大多集中在肿瘤细胞本身，也就是大家所认识的肿瘤生物学范畴；而随着医疗和科研水平的进步，人们认识到肿瘤异质性很大，尤其是患者之间更无从规律可循，并且肿瘤细胞可在周围环境产生变化之后发生进化，研究肿瘤细胞本身就变得困难重重。因此直到步入20世纪，人们才开始认识到要想战胜肿瘤，我们需要更强大的武器，那就是 人体自身的免疫系统 ，这样的科研导向也就促进了肿瘤免疫学这个热门研究领域的发展。
利用人体免疫系统来杀伤肿瘤 的方式最开始并不被人们看好，一方面是因为利用免疫系统治疗肿瘤的方式没有像手术、化疗那样立竿见影；另一方面是因为最开始科学家对复杂的人体免疫系统的认识并不透彻。随着人们对机体免疫系统的研究越来越深入，肿瘤免疫治疗近二十年才得以慢慢为世人所接受，其中最为引起轰动的是 2018年的诺贝尔医学奖授予了研究肿瘤免疫治疗的两位学者：Allison和Honjo 。他们分别揭示了免疫检查点CTLA-4和PD-1在肿瘤中的作用，从而为免疫治疗药物的临床应用奠定了基础。
免疫检查点抑制剂在很多肿瘤中都取得了良好的响应，这本应该是一个比较理想的结局，然而故事并没有那么简单，并且肿瘤的免疫治疗之路才刚刚开始。随着免疫检查点抑制剂投入到各种肿瘤的大型临床实验中，问题也越来越突出，那就是虽然有些肿瘤患者对免疫检查点抑制剂应答很好，但在另外很多肿瘤患者中免疫检查点抑制剂却根本没有任何疗效。同样的抗体，为什么会出现如此截然不同的结果？科学家开始研究导致这种现象的原因。
图1：
考虑到免疫检查点抑制剂主要是动员自身的免疫细胞来攻击肿瘤，那么很容易就可以想到的是会不会因为患者自身的免疫细胞的功能状态不同，从而对免疫治疗药物的应答不同呢。方向是有了，但似乎离科学家想得到的解释还有点距离。这是因为如果从整个机体的免疫系统出发，那问题就比较复杂，而且不够直接，这个问题直到免疫微环境的提出才得到更好的解决。研究者通过对多种肿瘤的肿瘤微环境分析后发现， 每一种肿瘤，甚至每一位患者的肿瘤浸润免疫细胞都存在差异 ，于是就有研究者根据免疫细胞浸润的特点将肿瘤大致分为 “冷”肿瘤 和 “热”肿瘤 ， 前者肿瘤中浸润的免疫细胞少以及较多比例的是免疫抑制性细胞（Treg,MDSC），对免疫治疗应答反应弱；后者肿瘤中浸润着较多的激活性免疫细胞（CD8+T,Th1），能对免疫治疗药物产生较好的应答反应。
2.肿瘤免疫分型分子机制
“冷”“热”肿 瘤概念的提出是 肿瘤免疫分型的雏形 ，而如果想进一步的理解免疫分型，人们就迫切需要知道究竟是什么原因会引起不同患者肿瘤免疫微环境如此大的差异。
众所周知，人体免疫系统是一个整体，其包括中枢免疫器官胸腺、骨髓以及外周免疫器官淋巴结、脾脏等，它们是各种免疫细胞的驻扎地，还需要淋巴管、血管等完成免疫细胞到局部组织的运输工作。肿瘤中很少有淋巴管，而血管含量丰富。那是不是肿瘤血管的含量是引起免疫细胞浸润的不同呢？答案是否定的，因为血管丰富的肿瘤反而浸润更多的抑制性免疫细胞，促进肿瘤的生长。故事说到这，就需要一些免疫学知识做支撑。 免疫细胞的定向迁徙除了受血管和淋巴管影响外，还需要一类重要的免疫分子：趋化因子以及趋化因子受体。如果将血管比作马路， 趋化因子就是信号灯，它们掌控着各种免疫细胞的走向 。
图2：
科学家通过研究发现，正是 肿瘤中各种趋化因子和趋化因子受体的种类以及含量不同，才会引起不同患者肿瘤浸润免疫细胞的巨大差异 。一些肿瘤细胞也因此利用免疫系统的这个特点，从而释放促进抑制性免疫细胞浸润的趋化因子，并高表达对应的趋化因子受体来吸引抑制性免疫细胞的浸润，从而有利于自身的生长。
第二章：肿瘤免疫分型的全面揭示
1.肿瘤三大免疫分型的提出
肿瘤免疫分型的理念被提出了，但科研不是哲学，光是理念是远远不够的，研究者需要用数据说话。 肿瘤浸润的免疫细胞肿瘤虽多，但大体可以分为两种，一种是可以发挥杀伤肿瘤作用的免疫细胞，如：NK, NKT, CD8+ T细胞；另一类则是发挥抑制免疫细胞杀伤肿瘤功能的细胞，如：Treg, Th1, Th3, M1, M2； 这些免疫细胞中功能最重要的就是T细胞，因为无论是何种形式的免疫细胞调控网络最后都需要T细胞的参与，而且目前各种免疫检查点抑制剂主要也是作用于T细胞来发挥抗肿瘤功能，因此揭示肿瘤浸润的T细胞功能是最重要的。
图3：
对肿瘤免疫分型的研究有很多，其中 比较受研究者广泛认可的就是肿瘤的三大免疫分型： “免疫浸润型” 、 “免疫排斥型” 、 “免疫沙漠型” 。研究者通过对肿瘤组织进行免疫组化染色后发现这三类显著的差异，在“免疫浸润型”肿瘤中，CD8+T细胞可以浸润到肿瘤内部；“免疫排斥型”肿瘤中，虽然也有较高的CD8+T细胞浸润程度，但都是集中在肿瘤外围；而“免疫沙漠型”肿瘤中很少有CD8+T细胞的浸润。
图4：
进一步的研究发现，“免疫浸润型”肿瘤内部表达较高的 MHCI 类分子 ，而另外两种类型的肿瘤中却MHCI分子的表达情况明显降低；此外，“免疫排斥型”的肿瘤外围表达较高的 细胞表面糖蛋白丝氨酸蛋白酶(FAP) ，这个基因主要负责塑造细胞外基质，可调控肿瘤外周形成一层厚厚的基质，从而阻断免疫细胞的浸润。
2.肿瘤免疫分型的量化
三大肿瘤免疫分型的提出为研究者提供了更加确切的证据，但同时也引出一个问题，就是对于很多患者来说被诊断出肿瘤时都已经是晚期；而且如果对每一位患者都进行组织切片，从而进行免疫组化染色来进行肿瘤分型是不切合实际的。因此，研究者在一个大型卵巢肿瘤队列中将数字病理和转录组数据分析进行结合，开发了一种机器学习方法来揭示肿瘤的分子分类和描述肿瘤免疫表型。通过使用随机森林的算法，研究者开发出了一个基于 157个特征基因的分类器 ，根据患者这些基因的表达情况，对患者进行肿瘤免疫特征分类。
图5：
3.影响肿瘤免疫分型的分子机制
“免疫浸润型”的肿瘤细胞表达较高水平的MHCI类分子而低表达FAP基因；而“免疫排斥型”的肿瘤细胞的MHCI类分子明显降低却高表达FAP基因。那么这两种机制有什么关联呢？哪一种才是引起不同肿瘤免疫特征的始动因素？研究者通过分析这两条路径的上下游调控机制，发现 无论是MHCI类分子还是FAP均受一个重要免疫分子的调控，那就是 TGFβ 。原来，肿瘤细胞为了逃脱T细胞的攻击，可以借助肿瘤抑制性免疫细胞(Treg,M2)产生TGFβ，后者一方面可以和肿瘤细胞上的受体结合，下调MHCI类分子；一方面可以和成纤维细胞上的受体结合上调FAP的表达，从而产生胶原蛋白形成厚厚的基质层包围在肿瘤周围，以排斥杀伤性免疫细胞的浸润。
图6：
第三章：肿瘤免疫分型的应用
说完了肿瘤免疫分型的基础知识，那么接下来我就介绍一些最近有关 肿瘤免疫分型的高分文章 ，希望能起到抛砖引玉的效果，引起大家进一步的思考。
应用1：m6A分子调控肿瘤免疫分型
近些年，肿瘤m6A修饰的调控机制也是研究的热门方向。热点碰撞会产生怎样的化学反应呢，下面首先介绍一篇发表在Molecular Cancer (IF:27.4) 的一篇文章，篇名为：m 6 A regulator -mediated methylation modification patterns and tumor microenvironment in filtration characterization in gastric cancer。
图7：
在开始讲解m6A和肿瘤免疫分型的联合分析之前，我先来介绍一些m6A的背景知识。这篇文章首先确定了21个m6A调节因子，包括8个Writers、2个Erasers和11个Readers。图7介绍的是这些分子的细胞分布和基本功能，简单来说m6A是对RNA的一种可逆的修饰方式，依靠Writers对RNA进行修饰，Readers进行m6A修饰信息的读取，当完成特定使命后又可以依靠Erasers对m6A修饰进行删除。
图8：
下面开始讲解这篇文章的主要内容，作者首先根据 m6A调控因子的表达对患者进行分类 ，随后发现这种分类和肿瘤免疫分型有很高的相似度 。于是作者就研究了肿瘤的m6A修饰和免疫分型的关系。最后发现依靠m6A特征基因算出的m6Ascore值在“免疫浸润型”、“免疫排斥型”、“免疫沙漠型”患者中的得分存在明显差异（图8A）。随后在抗PD-L1队列（IMvigor210）和抗PD-1队列（GSE78220）中，低m6Ascore的患者都具有显著的临床疗效(图8B)，并且显著的延长了生存率。此外，低m6Ascore患者的PD-L1明显高表达，这表明在对抗PD-1/L1免疫治疗中有潜在的反应。
总之， 这项研究基于21个m6A调节因子，区分了三个不同的m6A甲基化修饰模式，这三种模式具有明显不同的TME细胞浸润特性。 并且不同的m6A修饰模式之间的mRNA转录组差异与m6A和免疫相关的生物途径显著相关。作者建立了m6A score评分系统来评估每个胃癌患者的m6A修饰模式，从而在预测免疫治疗结果方面具有重要价值。
应用2：单细胞测序揭示卵巢癌免疫特征
单细胞测序是近几年兴起的一项革命性技术，它赋予了研究者在单个细胞水平研究各种细胞功能机制的能力。同样作为近些年高分文章中的常用技术，单细胞测序揭示肿瘤免疫分型会有什么样的惊喜呢，下面我就介绍一篇发表在Cancer cell (IF:31.7) 杂志上的一篇文章，篇名为：Single-cell dissection of cellular components and interactions shaping the tumor immune phenotypes in ovarian cancer
图9：
此研究首先对15名卵巢癌患者的肿瘤样本进行scRNA-seq（图9A），根据已知的细胞类型的标记物来定义细胞类型。结果表明，从整体看不同免疫分型的患者肿瘤细胞差异较大，同一免疫类型的肿瘤细胞能聚类到一起，不同免疫分型的肿瘤细胞差异较大（图9B）；此外，基质细胞（图9C）和免疫细胞（图9D）类型虽然在患者之间转录层面差异不大，但其相对分布情况差异很大，并且与肿瘤的免疫分型并没有明确关联。
文章进一步研究了肿瘤内在特征是否影响免疫浸润模式。分析结果显示，排斥型和浸润型的肿瘤之间没有显著的肿瘤细胞转录差异，但在排斥型和浸润型组合与沙漠型肿瘤之间有29个基因表达显著差异。对于这个结论我认为为排斥型和浸润型应该也有比较大的差异，只是单细胞测序需要制备单细胞悬液，可能破坏了这种结构。因而，用单细胞空间转录组进一步解析这两种免疫分型下的肿瘤细胞功能会更有意义，尤其是揭示免疫排斥型最外周的基质细胞层的特征将会为治疗这类患者提供更直接的参考价值。
基因集合富集分析显示，这些基因主要与增殖途径有关，它们的鉴定是由三种具有增殖分子亚型的沙漠型肿瘤所驱动的。另一方面，浸润型和排斥型肿瘤细胞在干扰素应答通路中显著富集，这主要是由编码主要组织相容性复合体(MHC)I类和II类加工和呈递的基因驱动的。此外，文章还观察到浸润型和排斥型肿瘤细胞中氧化磷酸化途径显著富集。
图10：
最后，作者为了总结这些观察结果，总结出了一个模型，在这个模型中，不同的成分和肿瘤、免疫和间质间的潜在串扰可能会形成不同的肿瘤免疫表型（图10）。模型中，TME中有免疫功能的肿瘤(包括浸润型和排斥型肿瘤)有许多不同于沙漠型肿瘤的共同特征。表达CX3CR1配体的内皮细胞和周细胞也可能参与浸润型和排斥型肿瘤中CX3CR1 肿瘤相关巨噬细胞的募集。浸润型和排斥型肿瘤之间也存在重要差异。在T细胞浸润型肿瘤中，浸润程度可能受到两个因素的影响：浸润型肿瘤细胞呈现出CXCL16的高表达，这可能与CXCR6+T细胞向肿瘤上皮的募集有关；此外，浸润型肿瘤中IL1 CAFs丰富，其可能通过CXCL12/ 14促进CXCR4的表达从而进一步募集T细胞。
这项研究通过 对15个临床卵巢癌患者的单细胞RNA测序分析，深入剖析了TME中不同的细胞、功能表型及其动态相互作用，使肿瘤免疫分型的特征更加丰富。 文章结果强调了可能形成肿瘤免疫表型的潜在分子机制，并可能为改善癌症免疫治疗的临床获益提供了治疗策略。
总结和展望
近些年，关于 肿瘤免疫分型 的机制探索无论是在临床研究还是基础科学研究中都是 炙手可热的方向 ，其产生的研究成果也非常有利于进行临床肿瘤免疫治疗药物的转化。
本文系统的梳理了 肿瘤免疫分型的来源、发展和应用 ，但只是窥全豹之一斑，仍然有很多细节需要大家自行补充。我是做肿瘤免疫基础研究的，近几年，发自内心体会到如今只简单的做经典的基因功能调控机制已很难再冲击高分文章，只有着手于具有潜在的临床应用价值的研究成果才能在如今科研浪潮下拔得头筹，而肿瘤免疫分型的研究正是符合了科研工作者的各种想象。
当然如果你并不是想发高分文章，只是想水几篇SCI，那么做一些较简单的肿瘤免疫分型也是不二选择。但从2021年已经发表的生信文章中可以看出，我们已很难再见到只分析纯肿瘤生物学特征的文章，将近90%的肿瘤生信思路文章或多或少都会联合免疫特征进行分析。如果之前你还不能意识到这个问题，那么阅读完此文的你就抓紧学习肿瘤免疫分型吧，相信在不久的将来也能发表一篇不错的肿瘤免疫分型相关的SCI论文。
Nagarsheth N, Wicha MS, Zou W. Chemokines in the cancer microenvironment and their relevance in cancer immunotherapy.Nat Rev Immunol.2017 Sep;17(9):559-572. doi: 10.1038/nri.2017.49. Epub 2017 May 30.
Desbois M, Udyavar AR, et al. Integrated digital pathology and transcriptome analysis identifies molecular mediators of T-cell exclusion in ovarian cancer.Nat Commun.2020 Nov 4;11(1):5583. doi: 10.1038/s41467-020-19408-2.
Zhang B, Wu Q, Li B, Wang D, Wang L, Zhou YL. m6A regulator-mediated methylation modification patterns and tumor microenvironment infiltration characterization in gastric cancer.Mol Cancer.2020 Mar 12;19(1):53. doi: 10.1186/s12943-020-01170-0.
Hornburg M, Desbois M, et al. Single-cell dissection of cellular components and interactions shaping the tumor immune phenotypes in ovarian cancer.Cancer Cell.2021 Apr 27:S1535-6108(21)00212-9. doi: 10.1016/j.ccell.2021.04.004.
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说起国自然研究新宠儿 “m6A甲基化修饰” ，想必大家都不陌生，m6A甲基化是包括mRNA和ncRNA（即非编码RNA，包括miRNA，rRNA，circRNA和lncRNA等）在内的所有RNA最普遍的表观遗传修饰。越来越多的证据表明，m6A甲基化修饰在各种生理和病理过程中都起着至关重要的作用。今天就向大家分享一篇发表在Molecular Cancer（IF：15.302）杂志上的关于m6A与ncRNA在癌症中相互作用的综述文章。
Part 1.初识m6A甲基化真面目
m6A，又称N6-甲基腺苷，指腺嘌呤的第6位氮原子（N）发生了甲基化修饰，通过甲基化酶复合物对甲基进行“书写”(Writer)、“擦除”(Eraser)或“阅读”(Reader)，进而对RNA发挥调控作用。
m6A甲基化的分子组成 —甲基化酶复合物
1)? 甲基化转移酶(methyltransferase)：被称为“编码器”(Writer)，主要包括METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429、METL16、RBM15 / 15B等；
2) 去甲基化酶(demethylase)：被称为“消码器”(Eraser)，主要包括FTO、ALKBH5等；
3)? m6A识别因子(recognition factors): 被称为“读码器”(Reader)，主要包括YTHDC1/2、YTHDF1/2/3、HNRNP、eIF3、IGF2BP1 / 2/3等。
图1.m6A甲基化修饰示意图：m6A甲基化是一个动态可逆的过程，由“Writer”、“Eraser”、“Reader”三者共同完成。
Part 2.m6A甲基化修饰miRNA
miRNA的失调参与多种生物学行为，如小鼠胎儿发育，免疫应答，炎症反应和致癌等，研究表明，m6A甲基化可以修饰参与多种miRNA的成熟，参与该过程的主要是甲基化转移酶METTL3和METTL14等：
① METTL3促进miR-25-3p成熟，miR-25-3p在胰腺导管腺癌（PDAC）中起关键作用；
② METTL3增强pri-miR-221 / 222与DGCR8的结合，而DGCR8参与了膀胱癌的增殖；
③ METTL3促进pri-miR-1246的成熟从而促进结直肠癌（CRC）的转移；
④ METTL3加速miR-143-3p的成熟，导致METTL3 / miR-143-3p / vasohibin-1轴的形成，有利于肺癌的转移；
⑤ METTL3通过修饰多个miRNA（miR-106b，miR-18a / b，miR-3607，miR-423，miR-30a，miR-320b/d /e）影响砷诱导的癌变；
⑥ METTL14促进pri-miR-126的成熟，从而可以抑制肝癌（HCC）的侵袭和转移。
图2. m6A甲基化修饰miRNA：调节胰腺导管腺癌，肺癌，肝癌，膀胱癌和结直肠癌等癌症的发生和转移
Part 3.m6A甲基化修饰lncRNA
lncRNA一般指长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA，可在癌症中被m6A甲基化修饰，参与该过程的主要是甲基化转移酶METTL3、METTL14，去甲基化酶ALKBH5，m6A识别因子YTHDF1、IGF2BP2等：
① MALAT1是首个被发现与肺癌相关的lncRNA，METTL3可以调节MALAT1-miR-1914-3p-YAP轴来诱导非小细胞肺癌的耐药和转移，还可以通过MALAT1/miR-145/FAK途径加重梗阻性肾病的肾纤维化；
② METTL3上调LINC00958，并使miR-3619-5p海绵化而促进HCC细胞的迁移和侵袭；
③ METTL3家族成员FAM225A充当海绵miR-590-3p / miR-1275的ceRNA和上调ITGB3来促进鼻咽癌（NPC）的发生和转移；
④ METTL3/14通过上调DKK1的lncRNA激活调节剂（LNCAROD）来增强头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的迁移；
⑤ METTL3介导lncRNA RP11通过Zeb1的上调增强CRC迁移和侵袭，而
METTL14增加lncRNA XIST的m6A水平，抑制CRC的增殖和转移；
⑥ ALKBH5通过维持FOXM1表达和细胞增殖程序来维持胶质母细胞瘤类干细胞（GSCs）的致瘤性，lncRNA FOXM1-AS可促进ALKBH5与FOXM1之间的相互作用；
⑦ ALKBH5通过减少lncRNA NEAT1的甲基化来促进胃癌（GC）的侵袭和转移。
⑧ YTHDF1与LINC00278相互作用可抑制食管鳞状细胞癌（ESCC）转移，而ALKBH5则促进ESCC转移；
⑨ IGF2BP2作为m6A读取器调节LncRNA DANCR，有利于胰腺癌的致癌性。
图3. m6A甲基化修饰lncRNA：参与多种癌症的肿瘤发生和转移，包括GSC，HNSCC，NPC，ESCC，肺癌，GC，HCC，胰腺癌和CRC
Part 4. m6A甲基化修饰circRNA
circRNA一般指环状RNA。环状RNA（circRNA）是一类特殊的非编码RNA分子（在活体中有时也有表达），也是RNA领域最新的研究热点。
circRNA在蛋白质翻译中起着至关重要的作用： METTL3和YTHDC1与环状RNA锌指蛋白609（circ-ZNF609）的代谢有关，并促进其生成，circ-ZNF609促进蛋白翻译和成肌细胞增殖；核糖体-circRNAs的“迷你基因”可以促进果蝇头部的蛋白翻译；
m6A甲基化会影响cricRNAs的蛋白质翻译： m6A基序在circRNA中富集，单个m6A位点被认为是启动circRNA翻译的触发器。m6A调控因子METTL3/14、FTO、YTHDF3和起始因子eIF4G2参与了m6A驱动的蛋白翻译。哺乳动物细胞可以识别circRNAs上的m6A修饰，通过抑制免疫基因激活和佐剂活性来抑制先天免疫。
circRNA的失调与多种癌症进展相关： circNSUN2的m6A甲基化修饰可促进细胞质输出并稳定HMGA2，从而促进结直肠肝转移；circPVRL3的m6A甲基化修饰可促进胃癌细胞的增殖和迁移。
表1：m6A甲基化修饰癌症中的ncRNA
Part 5. ncRNA调节癌症中的m6A甲基化
非编码RNA（ncRNA）具有影响涉及多个生物学过程m6A水平的能力。
miRNA调节癌症中的m 6 A甲基化：
① miR-33a通过靶向METTL3 mRNA抑制NSCLC细胞的增殖；
② miR-600抑制METTL3的表达并逆转了METTL3对NSCLC进展的积极作用；
③ miRNA let-7g通过靶向3’UTR下调METTL3表达，加速乳腺癌细胞的增殖；
④ miR-1266通过直接靶向FTO促进CRC的发生和发展；
⑤ miR-145通过靶向YTHDF2来抑制HCC的增殖；
⑥ miR-488是一种通过靶向eIF3a发挥作用的抑癌miRNA，还参与NSCLC细胞中eIF3a介导的顺铂耐药性；
⑦ miR-141通过形成miR-141 / IGF2BP2 / P13K / Akt轴来抑制胰腺癌的增殖。
lncRNAs调节癌症中的m?6?A甲基 化 ：
① lncRNA LINC00470与METTL3相互作用促进PTEN mRNA降解，从而促进GC进程；
② lncRNA miR503HG通过调节肝细胞癌中的HNRNPA2B1 /NF-κB途径来抑制肿瘤转移；
③ lncRNA LINC01234与HNRNPA2B1相互作用，促进NSCLC中的细胞增殖并抑制细胞凋亡；
④ lncRNA LIN28B-AS1与IGF2BP1相互作用，促进肺腺癌（LUAD）的增殖和转移；
⑤ lncRNA LINRIS可稳定IGF2BP2并促进CRC增殖；
⑥ lncRNA GAS5-AS1与ALKBH5相互作用调节GAS5的表达抑制子宫颈癌（CC）细胞的增殖，迁移和侵袭；
⑦ lncRNA GAS5可以抑制YAP介导的YTHDF3，从而抑制CRC的增殖；
⑧ lncRNA GATA3-AS增强KIAA1429和GATA3 pre-mRNA之间的相互作用，促进肝癌的进展。
表2：ncRNA调节癌症中的m6A甲基化
Part 6. m6A甲基化在癌症中的临床应用
m6A甲基化是癌症诊断和预后的新生物标记
① METTL3，YTHDC2和HNRNPC用于预测HNSCC患者的预后；
② METTL3/FTO上调或YTHDF2和METTL14下调可能预示GC、CRC和HCC的生存率较差；
③ METTL14低表达与肿瘤分化、临床分期、微血管浸润有关；
④ ALKBH5或FTO下调预示肺癌和HCC预后不佳；
⑤ IGF2BP2被认为是胰腺癌，食管胃交界腺癌和CRC的预后标记物。
m6A甲基化参与耐药性和癌症治疗
① METTL3稳定YAP和ARHGAP5，诱导NSCLC和胃癌顺铂耐药；
② HNRNPA2B1在他莫昔芬耐药乳腺癌中过表达，降低他莫昔芬的敏感性；
③ METTL3、METTL14、FTO、YTHDF2在急性髓性白血病（AML）中过表达，FTO抑制剂（FB23）及其衍生物（FB23-2）通过靶向FTO促进AML中的髓样分化和凋亡；
④ m6A甲基化参与胃癌的肿瘤微环境和TME浸润特征评估；
⑤ YTHDF2与炎症浸润，血管重建和远处转移相关，并预示肝癌的不良预后。
生信人往期也有很多有关m6A的好文章可学习：
m6A+免疫浸润
m6A+突变思路
m6A调节因子泛癌分析
结语
越来越多的研究关注于m6A甲基化如何改变ncRNA的稳定性、剪接和翻译，或ncRNA如何在癌症中调控m6A。m6A甲基化与ncRNA的相互作用可影响肿瘤细胞增殖、侵袭和转移等不同的生命活动。就m6A甲基化的临床应用而言，可作为癌症诊断、预后和治疗的潜在靶点。然而，m6A甲基化与ncRNA之间的特异性结合位点还需要进一步研究。
无论是对于正在为写标书申基金发愁的老师们，还是正在为毕业课题发愁的研究生们来说，相信这篇综述都能够帮助你更好的理解m6A甲基化与ncRNA之间的相互作用，为你的课题添光加彩，感兴趣的小伙伴们赶快阅读起来吧！
m6A甲基化发生在转录后，并富集于3’非编码区域、5’非编码区域和终止密码子附近的共识基序-RRACH基序（R表示A或G;H表示A、C或U)，m6A修饰是可逆的，它的动态化调节过程包括三部分，分别是“writer”甲基化酶，”eraser”去甲基化酶以及“reader”甲基识别蛋白，它们分别执行着不同的功能。甲基化酶负责将目标甲基化，一般是由甲基化酶METTL3、METTL14以及Wilms肿瘤相关蛋白WTAP组成METTL3/METTL14/WTAP复合物来催化形成的。”eraser”执行去甲基化的功能。在Fe2+及α-酮戊二酸的参与下，m6A甲基化可被FTO和ALKB同系物5(ALKB5）清除。显而易见，“reader”可识别甲基化信息，执行此项功能的蛋白有YTHDF1-3、YTHDC1-2、e IF3、hn RNPs、HUR、IGF2BPs等。显而易见，“reader”可识别甲基化信息，执行此项功能的蛋白有YTHDF1-3、YTHDC1-2、e IF3、hn RNPs、HUR、IGF2BPs等。
m6a甲基化名词解释：mRNA中，5’帽结构的甲基化很常见，腺苷的N6位置上(m6A)的甲基化也较为常见，tRNA是修饰最多的RNA，嘌呤上的甲基化很常见。
DNA甲基化是与基因表达的沉默相关的一种表观遗传修饰。Daniel Tenen及同事提出，活性转录直接调控DNA甲基化的水平。来自被研究很透彻的甲基化敏感基因CEBPA的一个非编码RNA与DNA甲基转移酶DNMT1相互作用，阻止在CEBPA位点上的甲基化，从而帮助CEBPA表达。
类型
甲基化包括DNA甲基化和蛋白质甲基化，DNA甲基化：脊椎动物的DNA甲基化一般发生在CpG位点（胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点，即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点）。经DNA甲基转移酶催化胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。人类基因中约80%-90%的CpG位点已被甲基化，但是在某些特定区域，如富含胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG岛则未被甲基化。
俗话说“文献是最好的老师”，但是隔行如隔山，在科研界，隔着一个领域就有一个巨大的鸿沟。就比如就算做肿瘤研究的人，看免疫学领域的文章还是会头皮发麻，看到总是记不住的CD4+ T细胞，CD8+ T细胞，各种CD分子就能让人头秃。不做表观遗传的人，看到甲基化，泛素化，乙酰化就害怕的想往后退。但学习的过程，就是把自己那胆小的脑细胞安抚一下，客服困难后获取知识的感觉如沐春风。
m6A甲基化，咋一听名字我就是拒绝的。甲基化我可以理解，m6A又是什么？它的功能是什么? m6A甲基化，对我来说就是一张白纸，我除了一个名字，全然不知。
以下将是一个m6A甲基化小白的拆解式了解
本文参考的文章有：RNA甲基化修饰——m6A概念，重磅前沿 实际上已知RNA已经存在超过100中修饰，下面是我在谷歌中找到的图
以下是果子推荐
看到这里，不由的点点头，嗯，m6A甲基化真的很重要呢！
title: 文献笔记-Where, When, and How Context-Dependent Functions of RNA Methylation Writers, Readers, and Erasersinfection
date: 2019-11-22 12:00:00
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tags:
注：以前看综述的时候，我喜欢把原文逐字翻译为汉语，效率比较低，现在我就采用笔记的形式的来看综述，按照原文的结构，把关键点记录下来，再加上自己的理解即可。
Hailing Shi, Jiangbo Wei, Chuan He,Where, When, and How: Context-Dependent Functions of RNA Methylation Writers, Readers, and Erasers,Molecular Cell,Volume 74, Issue 4,2019,Pages 640-650,
ISSN 1097-2765,
关于m6A的一些关键问题还没搞清楚，包括以下几个方面：
第一，m6A效应子针对转录本的选择性和m6A位点的选择性是如何实现的？
第二，m6A效应子（包括写入器，擦除器，读取器）是如何整合到不同的生物信号转导与调控过程的？
近年来，m6A RNA修饰的研究已成为当今生命科学领域最前沿最热门的研究方向之一，不断有CNS的文章问世，国自然资助的项目数量也逐年上升。
m6A是什么，m6A调控因子、m6A检测方法有哪些，m6A在人类疾病中扮演哪些作用。本文将做一简明阐述。
N6-methyladenosine也叫m6A，是一种广泛存在于mRNA上的碱基修饰行为，mRNA的内部修饰则用于维持mRNA的稳定性。
mRNA最常见的内部修饰包括了N6-腺苷酸甲基化（m6A）、N1-腺苷酸甲基化（m1A）、胞嘧啶羟基化（m5C）等。N6-甲基腺嘌呤(m6A)在 mRNA 内部修饰碱基中所占比例最大，主要分布在 G(m6A)C (70%)或者A(m6A)C (30%)保守序列中。
早在20世纪70年代，Desrosiers. R等在人哺乳动物细胞的 mRNA 中发现了m6A的存在，但m6A的功能以及作用机制却一直鲜有研究。
直到 2011 年，芝加哥大学何川教授团队在 *Nat Chem Biol *发表文章“N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO”，揭示m6A的可逆化修饰，使 m6A 的研究重新热门起来。
《figcaption style=“margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);“》图1 RNA常见的碱基修饰行为《/figcaption》
从图2中我们可以看到，这是一个已经发生甲基化的核糖核苷酸，确切地说叫N6-methyladenosine。
一共分为2个大的结构，左下角的是五碳糖，图2中a框部分也就是五碳糖的第二位C处的羟基发生脱氧就会变成脱氧核糖核苷酸（从RNA变成DNA）。图2中c框部分标注的，也就是第四位的C处通常会带有磷酸基。图2中b框部分通常就是我们所说的含氮碱基。
这里特指腺苷酸（A），当腺苷酸的第六位N处发生甲基化时，就是我们所说的m6A。
《figcaption style=“margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);“》图2 N6-甲基化腺苷酸结构示意图《/figcaption》
m6A这种甲基化修饰是可逆化的，调控因子包括甲基化转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白等。
甲基化转移酶包括METTL3/14、WTAP和KIAA1429等，主要作用是催化mRNA上腺苷酸发生m6A修饰。
而去甲基化酶包括FTO和ALKHB5等，作用是对已发生m6A修饰的碱基进行去甲基化修饰。阅读蛋白主要功能是识别发生m6A修饰的碱基，从而激活下游的调控通路如RNA降解、miRNA加工等。
《figcaption style=“margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);“》图3 参与m6A的酶类《/figcaption》
《figcaption style=“margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);“》图4 m6A调控《/figcaption》
甲基化转移酶（methyltransferase）也称为Writers，能够让mRNA上的碱基发生m6A甲基化修饰。METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1492都属于m6A甲基化转移酶的核心蛋白。这些蛋白会形成复合物（complex），共同行使催化功能。
《figcaption style=“margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);“》图5 METTL3、METTL14及其复合物结构《/figcaption》
m6A去甲基化酶主要包括FTO和ALKBH5等。FTO蛋白全称Fat mass and obesity-associated protein，属于Alkb蛋白家族中的一员并且与肥胖相关。
2011年，芝加哥大学何川教授团队首次证实， FTO蛋白是一种重要的去甲基化酶。ALKBH5是另一种重要的去甲基化酶，对细胞核中的mRNA进行去甲基化修饰。在细胞系中敲低ALKBH5后，mRNA上m6A修饰水平显著上升。
发生m6A修饰的mRNA想要行使特定的生物学功能，需要甲基化阅读蛋白，也称为reader。阅读蛋白主要包括YTH结构域的蛋白、核不均一核糖蛋白（hnRNP）以及真核起始因子（eIF）等。这些阅读蛋白的功能主要包括特异性结合m6A甲基化区域，削弱与RNA结合蛋白同源结合以及改变RNA二级结构从而改变蛋白与RNA的互作。
目前检测m6A所用的技术手段包括高通量测序、比色法以及液相色谱质谱联用（LC-MS），常用的方法主要包括MeRIP-seq、miCLIP-seq、LC-MS/MS以及比色法。 其中LC-MS/MS和比色法能够检测mRNA整体的m6A水平，而MeRIP-seq和miCLIP-seq属于高通量测序手段。
LC-MS/MS在液相质谱的基础上采用串联质谱，获得分子离子峰和碎片离子峰，对碱基同时进行定性和定量分析。
LC-MS/MS法第一步 使用TRIzol提取完总 RNA后，可以用oligodT磁珠或者rRNA去除试剂盒获得包括mRNA、lncRNA等在内的RNA。
第二步 使用核酸酶P1（Nuclease P1）将RNA消化成单个碱基。
第三步 加入碱性磷酸酶和碳酸氢铵后孵育数小时，将样本注射入液相色谱仪，计算各个碱基的含量。
第四步 进入质谱串联分析，单个核糖核苷酸会被打断成五碳糖和嘧啶或嘌呤。 最后 根据m6A和总腺嘌呤的比例就能算出m6A在mRNA上整体的甲基化程度。
LC-MS/MS为最早检测m6A的方法，操作较为繁琐。相对于LC-MS/MS较为繁琐的操作，比色法更为简便。研究人员既可以提取total RNA，也可以利用oligodT磁珠富集mRNA。
《figcaption style=“margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);“》图6 m6A检测方法 （A）LC-MS/MS法；（B）比色法。《/figcaption》
2012年之前，全基因组或全转录组水平上鉴定m6A修饰的研究领域是一片空白。
2012年Meyer K. D发表于 Cell 上的论文“Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3’ UTRs and near stop codons”和Dominissini D发表于 Nature 上的论文“Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq”第一次从转录水平上，大范围、高通量地鉴定了人和小鼠m6A的甲基化水平。
这种方法被称为MeRIP-seq或m6A-seq。
MeRIP-seq操作 第一步先对mRNA进行片段化，接下来使用带有m6A抗体的免疫磁珠对发生m6A甲基化的mRNA片段进行富集，然后将富集到的mRNA片段纯化后构建高通量测序文库进行上机测序。另外需要单独构建一个普通的转录组文库作为对照。最后将2个测序文库放在一起进行生物信息学分析，得到m6A甲基化程度较高的区域（m6A peak）。
这种方法优点是方便快捷成本低廉，可以对发生高甲基化的mRNA区域进行一个定性分析。但是MeRIP-seq只能鉴定m6A高甲基化的区域，并不能做到单碱基的分辨率。
2015年，Bastian Linder等发表在 Nature Methods 的文章“Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome”，第一次从单碱基的水平测定m6A。
这种技术被称为miCLIP-seq。
miCLIP-seq操作第一步对富集完的mRNA进行片段化。
第二步，使用带有m6A抗体免疫磁珠与带有m6A的mRNA片段进行结合。
第三步，使用紫外交联进行免疫共沉淀后，在mRNA片段的3’端连上接头序列，在5’端加上P32放射性标记后进行移膜。
第四步，根据放射性标记进行切膜回收后，对mRNA片段进行反转录和纯化回收。
第五步，对反转录组的cDNA进行环化。
第六步，对环化的cDNA进行复线性化，然后构建测序文库上机测序。
《figcaption style=“margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);“》图7 高通量测序检测m6A （A）MeRIP-seq；（B）miCLIP-seq《/figcaption》
1. 肿瘤
2020年3月发表于 Cancer Cell 上的综述性文章“m6A Modification in Coding and Non-coding RNAs: Roles and Therapeutic Implications in Cancer”，文章指出，m6A相关修饰酶在肿瘤中的变化不尽相同，环境改变和位点突变均可导致m6A状态的改变，同时m6A参与一些肿瘤靶向治疗基因的调控。
《figcaption style=“margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);“》图8 m6A相关修饰酶在肿瘤中的变化《/figcaption》
2. 病毒感染
2020年2月发表于 Nature Microbiology 上的文章“N6-methyladenosine modification enables viral RNA to escape recognition by RNA sensor RIG-I”，文章指出，人类偏肺病毒（HMPV）在其RNA中获得m6A，可以模仿正常细胞的RNA，躲避免疫系统的检测。
《figcaption style=“margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);“》图9 病毒中m6A的作用《/figcaption》
3. 神经脱髓鞘改变
2020年1月发表于 Neuron 上的文章“m6A mRNA Methylation Is Essential for Oligodendrocyte Maturation and CNS Myelination”，文章指出，m6A去甲基化酶METTL14的减少会导致少突胶质细胞的减少及中枢神经的脱髓鞘改变，提示m6A在神经细胞的发育中起着重要的调节作用。
《figcaption style=“margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);“》图10 m6A对神经系统发育的调控。《/figcaption》
m6A的研究热点不断升级，今后会有更多的高分文章出现，关联的疾病也会越来越多。
但是，m6A的检测方法较为繁琐，所需费用也比较高，限制的m6A的研究进展以及临床应用，发展快速简便经济的检测方法是今后m6A检测技术的发展方向。
同时在研究层面，m6A作为十分重要的 RNA 表观遗传学修饰，如何与 DNA、组蛋白表观遗传学协同作用调控基因表达，也需要进一步深入探索。
参考文献
本文首发于“解螺旋”微信公众号
表观遗传学，包括组蛋白共价修饰(covalent histone modification)、DNA甲基化修饰(DNA methylation)、RNA甲基化修饰(RNA methylation)、基因组印记(genomic imprinting)、基因沉默(gene silencing)、RNA(RNA editing)及非编码RNA(noncoding RNA)等，是 指在核苷酸序列不发生改变的情况下，生物表型或基因表达发生了稳定的可遗传变化 。
RNA甲基化 作为表观遗传学研究的重要内容之一，是指发生在RNA分子上不同位置的甲基化修饰现象， 6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A) 和 5-甲基胞嘧啶(C5-methylcytidine，m5C) 是真核生物中最常见的两种RNA转录后修饰。RNA甲基化在调控基因表达、剪接、RNA、RNA稳定性、控制mRNA寿命和降解等方面可能扮演重要角色。 相对于DNA甲基化，RNA甲基化更加复杂、种类繁多、普遍存在于各种高级生物中。
已知绝大部分真核生物中，mRNA在5’ Cap处存在甲基化修饰，作用包括维持mRNA稳定性、 mRNA前体剪切、多腺苷酸化、 mRNA运输与翻译起始等。而3’ polyA发生的修饰有助于出核转运、翻译起始以及与polyA结合蛋白?起维持mRNA的结构稳定。但是这些修饰只发生mRNA的头部和尾部，关于RNA的内部修饰（internal modification）在许多种类的RNA中都有发?。无论是mRNA还是lncRNA，都大量存在m6A修饰。m6A能够加速mRNA前体的加工时间，加快mRNA在细胞中的转运速度和出核速度。主要学习研究较多的m6A。RNA的m6A甲基化?共有大三类酶参与： Writers、 Erasers和Readers ，需要相关研究的可以学习相关文献。
检测m6A的方法非常多，如包括MeRIPseq、 miCLIP-seq、 SCARLET、 LC-MS/MS等。2012年之后，两篇发表于Nature和Cell上的论?可以说是第?次从转录水平上，大范围高通量地鉴定了人和小鼠m6A的甲基化水平（Dominissini 2012和Meyer 2012）。这两篇独立发表的论文采用的 核心方法就是《u style=“box-sizing: border-box; user-select: text !important;“》将m6A抗体与带有m6A的mRNA片段相结合《/u》后进行高通量测序 。通过对下机数据的分析，来鉴定mRNA上m6A程度较高的区域，分辨率约为100nt。这种方法我们称之为MeRIP-seq（ me thylated R NA i mmuno p recipitation sequencing）或m6A-seq。
MeRIP-seq建库步骤 ：
1. 提取total RNAs，并用Oligo-dT磁珠对total RNAs带有polyA的mRNA进行富集（通常要求Total RNA 300ug，人鼠可以做微量2ug 但结果可能会出现map率低dup率高 建库步骤与常量也有区别）；
2. 用磁珠进行富集，得到带有polyA的mRNA。之后加入片段化试剂，将完整的mRNA进行片段化。或者使用超声波仪直接进行片段化；
3. 将片段化后的RNA分成两份。?份加入带有m6A抗体的免疫磁珠，对含有m6A甲基化的mRNA片段进?富集。另?份作为control，直接构建类似常规的转录组测序文库（这一步就是IP步骤，片段化程度、抗体抓取效率都会影响到后期实验结果；这里的control通常称为Input）；
4. 对m6A抗体免疫磁珠进行富集，带有m6A的mRNA片段进行回收后，按照转录组的建库流程构建常规的测序文库；
5. 分别将构建好的2个测序文库，即m6A-seq library和RNA-seq library分别进行高通量测序。测序平台保持一致，推荐Hiseq X ten或Novaseq；
6. 对下机数据进行生物信息学分析，对发生m6A甲基化程度较高的区域进行peak calling。由于不能做到单个碱基的分辨率，所以只能对大致的区域进行分析。从下图中我们可以发现，与右侧常规的转录组测序结果相比，在基因上有两处区域存在非常明显的高甲基化峰；
7.接下来会进行一些常规分析，如peak区域基因注释，差异peak分析。
以上就是关于m6A-seq的标准步骤，现在是不是对m6A-seq有了一个非常直观的认识呢？ 再次强调下，这种测序方法只能鉴定高甲基化的区域，并不能做到单碱基的分辨率。
思路1 老数据挖掘
第一步：先从原有的转录组数据中，挖掘到差异表达的甲基化酶；
第二步：对挖掘到的甲基化酶如METTL3或FTO等进?qPCR验证，并进行m6A-seq分析哪些基因甲基化水平发生改变；
第三步：在细胞（动物模型可选）中对这些酶进行敲低和过表达，进行常规的qPCR和WB检测相关酶表达情况，并用LC-MS/MS法检测RNA整体m6A水平；
第四步：继续对这些敲低和过表达的细胞进行转录组测序/小RNA测序或表达谱芯片/小RNA芯片，分析哪些基因出现差异表达变化和可变剪切变化；
第五步：找到甲基化酶调控的靶基因，进行敲低和过表达，看甲基化酶缺陷的细胞或动物模型表型能否补救；
第六步：在确定上一步靶基因确实受到甲基化酶调控后，对靶基因上的motif进行点突变后进行验证；
第七步：鉴定新型的甲基化酶（可选）。
思路2 研究甲基化修饰差异基因
第一步：直接进行m6A-seq和转录组测序，找到时间顺序或差异表达的基因并用qPCR、 WB等?法验证，此外找到m6A有差异的基因；
文玩金刚菩提的价格一般是多少？这个四瓣的金刚菩提子大概在什么价位啊 ♂
文玩金刚菩提的价格一般是多少？这个四瓣的金刚菩提子大概在什么价位啊- 文玩金刚菩提的价格一般是多少
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金刚的价格影响因素不外乎就是瓣数和产地这两个。瓣数是越多瓣的越稀有，价格也就越贵。而产地是以尼泊尔的最好，所以尼泊尔的最贵。一般四瓣五瓣的最普通，价格最便宜几元一颗，一串也就20—30左右。六瓣的贵些，大小而定，20mm以内，一串在40到80,20mm以上价格波动较大，几百一串。也可以去一些关于文玩的平台了解，比如文玩御斋、文玩天下、文玩部落等。
四瓣尼泊尔金刚菩提子手串300-600，印尼四瓣金刚菩提子手串60-150
金刚菩提子（Rudraksha），大型常绿阔叶树木。学名是Elaeocarpus ganitrus，属杜英科植物。 主要生长在海拔2000多米以上的高原地带。
常绿阔叶树木。主要生长在喜马拉雅山山麓的恒河平原到东南亚，尼泊尔，印度尼西亚，新几内亚，澳大利亚，关岛，和夏威夷地区。
看具体物件的瓣数，大小，纹路、庄形等等，瓣数越多价格越高，矮桩。满肉价格就高，20mm左右的，五瓣六瓣的价格从几元一颗到几十一颗甚至上百一颗的都有的
要看尺寸，纹路，桩形等等，如果是经济条件一般的初玩者，两三百的就行。不用太刻意讲究纹路，桩形，只要不是糠籽就行。200起到几万，价格不等。文玩市场水太深。
四瓣和五瓣金刚菩提子价格参照：（每颗）由于4和5瓣是最普通的，价格相对较便宜，直径低于20mm的价格从1元-5元不等4瓣15mm应低于1元4瓣15-20mm价格在1.5元-8元之间5瓣20mm（不含20mm）价格应控制在3元以内六瓣金刚菩提子价格参照：（每颗）金刚菩提的价格一般在瓣数多一瓣，价格几乎是翻一番6瓣17mm价格约在：1.5-2元之间6瓣18mm价格约在：2-3元之间6瓣19mm价格约在：3-5元之间6瓣20mm价格约在：5-7元之间大于20mm价格相对浮动较大6瓣21mm价格约在：10-15元之间6瓣22mm价格约在：20元上下/颗七瓣金刚菩提子价格参照：（每颗）7瓣20mm以下的价格也要50元左右超过20mm的，品相好，圆度高的菩提价格都要在100元左右7瓣20mm价格约在：50-70元7瓣21mm-25mm价格约在：100-200元左右八瓣、九瓣金刚菩提子价格参照：（每颗）8瓣20mm-25mm价格约在：150-300元之间，超过25mm每增加毫米价值几乎翻番。9瓣的价格相对八瓣有所升高，价格约在300元上下，这个也要分直径大小了。十瓣金刚菩提子价格参照：（每颗）10瓣的一般可遇不可求，价格单颗超过500元，直径大的在700-1000元左右。其它瓣数的金刚菩提子价格参照：（每颗）金刚菩提子10瓣、11瓣价格：每颗600元以上金刚菩提子12瓣价格：每颗1000元以上金刚菩提子13瓣、14瓣价格：每颗3000元以上金刚菩提子15-19瓣价格：每颗8000元以上金刚菩提子20瓣及以上价格：每颗2万以上因为除了办数，尺寸、桩型、品相其他因素也决定金刚的价格，所以只能参照不能直接衡量。希望有帮到你！（龙巅藏品）
金刚分大金刚，小金刚，又以瓣数，桩型，纹路的不同制定价格。一串六瓣，大金刚普通版估计200-300，小金刚贵些500-1000，还有更贵的，主要看个人的经济能力。不过也有便宜的，几块到十几一串，那叫通货，大概2-4串可以条一串将就的，不建议买，一分价一分货的
就算你在大概的很也个准价格，主要看品相，见过最便宜的一串9.9包邮，最贵的一颗就几万，一般金刚文玩爱好者都是买100~5000的吧，这都不是最主要的，最重要的就是别买贵了，100过贵吧？但是买的金刚就值50，也是不值的，重要的你得会看，什么品相是好的，什么价格大概买那种品相，这里说的品相主要是指肉度，文理形状，桩形，当然还有一串颜色要统一，文理大小要统一等等，去贴吧学习交流一下吧，看我的200，同树姜黄皮5瓣飞碟双龙，当然有些人说这个还达不到飞碟
黑石林香烟现在的价格是3600元1包，180元1支，一条就要3.6万元，而且有钱不一定买得到。
“石林”牌卷烟是云南曲靖卷烟厂1974年创牌的烤烟甲级卷烟，创牌取名于“天下第一奇观”——千仞壁立、群峰叠嶂的云南石林。老烟民都应该清楚这个牌子。当初推出石林这个品牌的时候，依据的就是石林风景区，都是间接反过来宣传和推动当地的产物。但是石林牌香烟旗下的一款如今成了终归最贵的烟，就是黑石林香烟。
江湖人称--黑石林，“珍品石林”是石林系列中的最高端产品，只在2004年左右生产过很少量。随着年限的增加及市场需求，物以稀为贵，产品价格自然就很高了。中国最贵的香烟多少钱一包?2005年在烟贩手中见到的时候要价60元/包，后来就涨到了80元/包。听说现在已经涨到280元/包，3200元/条。但是黑石林这个中国最贵的烟如今却能成为稀缺货，炒到几万元的价格。
“珍品石林”以其咖啡黑红色的外包装和纯黑色的烟支外观赢得了“核武器”的称号。我们大家俗称之为“黑石林”，也许现在也难觅它的踪影了。
黑石林香烟介绍，“石林”牌卷烟是云南曲靖卷烟厂1974年创牌的烤烟甲级卷烟，创牌取名于“天下第一奇观”——千仞壁立、群峰叠嶂的云南石林。1987年，经国家烟草总公司评比鉴定，评为国家烟草优质产品，随即，又被国务院列入全国价格放开的13种烟之一，1988年获首届中国食品博览会金奖，在全国最受欢迎的十个牌号卷烟中名列第四。
1995年，“石林”被全国产品(服务)质量消费者跟踪调查活动组委会推荐为“消费者满意产品”;1997年，“石林”被评为“云南省首批名牌产品”，被国家烟草专卖局评为“1997-1998年度名优卷烟牌号”，是1998年国家率先放开价格的十种名优卷烟之一。
“石林”的“娘家”是云南曲靖卷烟厂，该厂在全国烟草行业中综合实力及经济效益位列第四，中国500家最大的工业企业中效益最佳企业之一，烟草行业的前十强。实力不凡。1998年，曲烟企业正式通过ISO9002国际质量体系认证，质量管理已与国际接轨。在烟草行业新的机遇和挑战面前，曲靖卷烟厂将一如既往，始终坚持“诚信经营、质量为本”的宗旨，做精做强做大品牌，走可持续发展之路，实现企业的持续、稳定、健康发展。
应该没有黑金刚石材，您讲的应该是黑金沙。分国产与进口两种，国产的价格在120-280元/平米左右，主要还是看您做什么用？过门石、窗台板、各类，量少的话价格相对贵一些。个人愚见，望参考
咨询记录 · 回答于2021-10-12
云烟黑金刚美宜佳多少钱一包
亲，您好，根据现在市场价格是16元一包的，现在是16元一包的。
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文登之窗信息港二手车（想知道：宜宾市 淘车港二手车市场 在哪）- 想知道：宜宾市 淘车港二手车市场 在哪
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文登汽车站(文登汽车站官网)“文登短途汽车站来电较多？文登短途汽车站打多少电话”
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在文登汽车站坐几路车到文登火车站
从巴士站乘坐巴士 No。4 向西步行到火车站。
文登市汽车站发车时刻表
文登至北京大巴发车时间烟台交通集团牟平汽车站发车班车时刻表终点站示范路线站发车时间运行时间赤峰宇通卧铺天津、北京、承德8：30 约18小时唐山宇通卧铺 莱州、塘沽、汉沽15：30 关于12小时上海尼奥普兰卧铺太仓、张家港15：30 约12小时天津青年东营、黄骅、塘沽8：30、14：00 约10小时莱钢豪华舒驰 莱州蓬莱6：45 约6小时：青岛沃尔沃高速直达6：20， 7：30， 大约3点。5小时青岛金龙、北奔驰莱阳、即墨7：00、8：00、13：30、14：30约4小时青岛依维柯莱阳、即墨5：30、6：00、8：30约4小时潍坊宇通高速直达 6：20 约 4.5小时 莱阳舒池崖子、法城 6：30 约2小时 莱阳舒池陶村、徐家店 6：50、10：00、11：00、13：00、15：00、17：00 约2小时 济南大禹、金龙莱州， 潍坊 6：50， 7：40， 8：00， 9：00 约6.5小时淄博宇通黄县潍坊8：30（隔日）约5小时仙河金龙东营古道7：10 约8小时滨州金龙潍坊寿光7：20 约7小时黄岛金龙胶州莱西15：30 关于5小时郑州宇通卧铺 菏泽、开封、兰考 16：00 约12小时景德镇北奔驰卧铺 淮安、南京、黄山 12：40 约18小时 临沂蜀赤居县、诸城市 8：30 约9小时 聊城 宇通济南、淄博9 ：30（次日）约9小时郯城豪华舒池临沂、莒县10：00（次日）约7小时东村舒池刘家矿6：30、13：25约2小时东村舒池竹旺、马岭8： 30、11：40 2小时左右 蓬莱书池开发区、大吉家 7：00、9：15、15：15 2小时左右 荣成金龙文登、王团 6：50、13：00 约2小时 文登书池楚村、王团6：20， 8：30， 10：30， 15：30 约1.5小时 浮山牡丹黄屋、五台 6：40-17：30 每小时约1小时 威海书池楚村、酒馆 6：40-17：30 每半小时约1.5小时烟台舒池东站，振华大学5：30-19：30每十分钟约70分钟养马岛舒池盐滩天马广场5：30-17：30每15分钟约30分钟招远豪华舒池栖霞14： 10、15：10 约2.5小时威海中通楚村，酒馆11：15， 16：40， 17：30 约1.5小时龙口中通黄县14：00左右2。山前5小时，中通居各庄，林子溪，胜各庄9：30，16：00，约1.5小时各格庄舒池航道 马梯市河南村 9：30， 15：50 约1小时铁矿中央航道 乳山河南村 11：20， 17：10 约2.5小时远光书池文登、张家禅、石岛14：00左右2.5小时通过樟陂和林子溪口岸口11：30左右2.5小时 南黄蜀赤水道 河南村 逢甲 7：00， 13：00， 14：30 约2.5小时东坡头中通居各庄、林子溪、胜各庄7：00、13：00左右1.5小时 嘉口金龙居各庄、林子溪、胜各庄 8：50、15：20 约1小时 桃村舒池大沽头、少里、布溪头 14：10 约2小时 东村舒池 玉里、竹旺、马岭 13：00 约2小时 河南冯家中通村水道、中斋9：50、15：40 约1小时文登中通旺团、楚村流水发车约1小时。5小时（旅游包车服务热线：13953513058）；
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