ELISA实验结果求助
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- 影响elisa实验结果有哪些因素
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- ELISA实验数据处理方法是怎样的
ELISA实验本来也是比较容易受环境影响的
1、同一个人相同试剂两次实验结果差距较大。
这种情况可能发生，你可以再重复2次试验，观察一下
2、相同浓度包板结果CV值大，总是会出现一两个孔反常现象
是一次还是2次试验结果呢，如果仅是1次这样，很正常
3、倍比稀释后包板出现某两个浓度之间OD值差距达到两倍左右
个人感觉这个也正常、
ELISA酶联免疫吸附实验
1.原理：免疫分析是一种利用特定抗体与抗原或半抗原发生的高选择性高特异性识别和结合原理，对待测抗体或者抗原进行分析测定的方法，酶联免疫吸附分析（下称ELISA）是免疫分析的一种，分三个部分组成：免疫识别，信号输出和数据处理。
2.步骤：免疫识别是在聚苯乙烯制成的96孔板上包被抗体，而后利用抗体识别待测的抗原（通常是疾病的蛋白质生物标记物，病毒，细菌等等，从复杂待测液中将抗原吸附到96孔板表面。接着用带有辣根过氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）、荧光或放射性标记的抗体通过直接或者间接的方式输出识别信号。最后利用信号强度，标准样品浓度梯度等信息计算得出待测样中目标抗原的浓度。
3.分类：根据免疫识别和信号输出方式的不同，ELISA可以分为双抗体夹心法、直接免疫竞争法和非直接免疫竞争法等等。其中双抗体夹心法在商业应用上最常见。
双抗体夹心法：
①：抗体包被 在96孔板上包被抗体。由于酶标板是由聚苯乙烯制成，其含有的苯环与抗体的氨基酸残基具有类似π-π堆积作用的引力，结合静电和疏水作用，可以将抗体吸附于其表面。然后，将未吸附的抗体用缓冲液清洗后，加入含有明胶或牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）的封闭液以封闭酶标板上未结合抗体的部分。加入封闭液的目的，是防止其他蛋白因静电或疏水作用吸附在96孔板上，造成假阳性信号，干扰后续实验的进行。
②：免疫识别 在96孔板上包被抗体后，加入待测样，并在37°C环境下孵育一段时间，通常是1-2小时。此时酶标板上的抗体与待测抗原进行特异性识别结合。此处抗体的质量是关键，好的抗体既能特异性高效地结合抗原又不受待测样中其他生物大分子、蛋白质和无机盐等成分的影响。
③：洗板 将未结合的抗原洗掉，加入该抗原所对应的识别抗体并在37°C下继续培养1-2小时，接着将未连接上抗原的抗体洗掉。
④：酶标信号输出 加入带有辣根过氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）标记的酶标二抗，用于和标准抗体结合。在培养30分钟后洗掉未连接的二抗，并加入显色剂显色。根据显色的结果判断抗原的浓度。一般认为，抗原浓度与显色后的发光强度呈正相关。
免疫竞争法
以抗原竞争抗体为例，在上述免疫夹心法操作步骤的第二步加入待测抗原后，立刻加入酶标抗原，使之与待测抗原竞争识别酶标板上的抗体。当待测抗原浓度越高，能够连上酶标板上抗体的酶标抗体就越少，输出的信号就越少。这样待测样浓度与酶显色信号就呈逆相关。
1. ELISA的原理
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
操作步骤:
1．从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压 实自封条，密封口袋，放回4℃。
2．空白孔加标准品和标本稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育90分钟。
3．提前20分钟准备生物素化抗体工作液。
4．洗板5次。
5．空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育60分钟。
6．提前20分钟准备酶结合物工作液。避光室温(22-25 ) ℃ 放置。
7．洗板5次。
8．空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱，避光孵育30分钟。
9．打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。
10．洗板5次。
11．加入显色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分钟。
12．加入终止液100ul/孔, 混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果。
13．实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存至有效期结束。
建议保存酶标板框，以备下次或者今后试验使用。
影响ELISA试验效果常见问题原因分析及解决办法
ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果。我将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下，以期给同行带来一些启发，提高试验质量。
操作步骤
可能原因
解决办法
选择试剂
选择质量优良的检测试剂，严格按照试剂说明书进行操作，操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟。
加
样
1.血清或血浆标本分离不好即进行加样；
2.手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长(特别是室内温度较高时)；
3.加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。
1.标本为血清：最好将血液先自然存放1-2小时后，再用3000rmp离心15分钟；标本为血浆：必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必须立即颠倒采血管混合5-10次，放置一段时间后，3000rpm离心15分钟；若在几天内检测，可放在2-8℃冰箱中，若要贮存，则置于-20℃的低温冰箱内。
2.加样后及时放入孵箱。
3.加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。
4.如果采用AT或其他全自动加样，最好选择FAME或其他后处理仪器加酶试剂。
5.标本较多时，请分批操作。
孵
育
1.孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底；
2.孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。
1.贴封片或加盖；
2.按说明步骤严格控制操作时间。
洗
板
1.采用手工洗板,孔与孔之间液体交叉。
2.采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底；洗板针堵塞，抽吸不完全；洗板不畅，导致洗板效果差。
3.反应板过多造成洗板等待时间长。
1.保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好在吸水纸（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干；
2.合理安排，或多用几台洗板机。
显
色
1.
显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂；
2.
加显色剂时溅出孔外造成液体回流。
1.
显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用；
2.
加样时保持显色剂不外流；
3.A、B液应避免接触金属器械。
终
止
加终止液时产生较多气泡，导致假阳性增加。
加终止液时应避免产生气泡。
读
板
读板时板底不清洁。
应保证酶标板清洁。
全过程
1.整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸;
2.实现ELISA检测标准自动化，有效提高检测质量。
在实际操作中，除了选择优良试剂外，必须严格按照操作步骤进行操作，同时作好室内质控、室间质评，以严谨的工作作风检测每一份标本，才能保证检测质量。现在国内已有相当数量的单位拥有全自动酶标仪，这对于实现ELISA标准化检测、提高检测质量起到了重要作用。
没错，你的蓝色分数已经远超过其他颜色的分数了，所以你是蓝色性格的人 蓝色优势 依．思想深邃，独立思考 贰．成熟稳重，安全放心 红色喜欢刺激．蓝色喜欢安全．黄色喜欢挑战．绿色喜欢稳定． 三．情感细腻，体贴入微 四．一诺千金，忠诚情谊 因为他们在承诺上的高度注重和甘愿以生命来维护的态度，蓝色得以成为四种性格中最值得信任的人群． 蓝色对人忠诚，黄色对事忠诚．蓝色对人负责，黄色对事负责．蓝色富有责任心，黄色富有责任感． 5．计划周详，注重规则 ＂做任何事情首先指定好计划，然后严格地按照计划去执行＂，也许这是蓝色做事的原则中仅次于＂要么不做，要做就做到最好＂最高座右铭只后的第二准则． 红色喜欢变化中新奇的不确定的快乐，而蓝色喜欢计划中程序的安全感和稳定． 黄色：用什么猫捉不重要，捉到老鼠最重要．蓝色：捉到老鼠很重要，用什么猫捉和怎么捉的同样重要．红色：捉老鼠并不重要，捉老鼠好不好玩最重要．绿色：你们嫌不嫌烦啊，老鼠不去管它，放在那里不是也蛮好的吗？ 红色：不喜欢被规则束缚的人，偶尔不按规则出牌会觉得新鲜有趣．黄色：打破规则的人，他们更希望由自己来制定规则而不是遵守规则．绿色：害怕违反规则的人，但绿色可能因为懒散而无法达到规则的要求．蓝色：最遵守规则的人，并且竭尽全力作到规则内的最好． 陆．讲究精确，迷恋细节 蓝色是完美主义者，他们希望成为最好，找到最好，并且努力做到最好．他们辛劳地努力工作，喜欢做高质量的工作，即使这以为着要花更长的时间，付出艰巨的努力，也在所不惜．对于他们来将，如果这个事情值得做，那就一定要做到最好．任何的松懈和放低标准让他们感到自己良心的谴责，那将是一种奇耻大辱． 漆．考虑全面，善于分析 蓝色是最有潜力成为理财高手的人． 当黄色力图用最简捷的方法解决最复杂的问题时，蓝色也许正在用最复杂的方法诠释见得问题以确保周详和严谨．而正是如此，他们经常运用现有的一个观点并使他发展，他们具有发明家的思想和本领．因此，黄色是把复杂问题简单化，兰色可把简单问题复杂化． 吧．执着有恒，坚持到底 红色要大快乐，但是小快乐一个也不能少．而蓝色如果有大快乐，小快乐我宁可一个都不要． 蓝色的天然优势 作为个体 严肃的生活哲学 思想深邃，独立思考而不盲从 沉默寡言，老成持重 注重承诺，可靠安全 谨慎而深藏不露 坚守原则，责任心强 遵守规则，井井有条 深沉的理想主义者 敏感细腻 高标准，追求完美 谦和稳健 善于分析，富有条理 待人忠诚，富有自我牺牲精神 深思熟虑，三思而后行 坚韧执着 沟通特点 享受敏感而有深度的交流 设身处地地体会他人 能记住谈话时共鸣的感情和思想 喜欢小群体叫的思想碰撞 关注谈话的细节 作为朋友 默默地为他人付出以表示关切和爱 对友谊忠诚不渝 真诚关怀朋友的境遇，善于体贴他人 能够记得特殊的日子 遭遇难关时，极力给予鼓舞和安慰 很少向他人表达内心的看法 经常扮演问题分析的角色 对待工作和事业 强调制度，程序，规范，细节和流程 做事之前首先计划，且严格地按照计划去执行 喜欢探究及根据事实行事 尽忠职守，追求卓越 高度自律 喜欢用表格，数字的管理来验证效果 注重承诺 一丝不苟地执行工作. 这些都是蓝色性格的特
1.不同时期抗体水平的变化（OD值），即对照组与实验组有无区别（统计学上的区别）。
2.分析个体动物抗体水平达到明显高于对照组的时间差异，用方差分析先看总体上有无差异，然后两比较，看出现差异的每对之间是否由于一些相同的因素而导致了差异的出现，如年龄、性别、体重。
3.影响抗体产生的因素很多，如注射的部位、注射时的情况（准确与与否，量的多少等）、有无使用佐剂、佐剂的配制好坏、免疫的频率、动物的健康状况等均可影响抗体的产生，细致的分析需要做好这些详细的记录，这样在后面的分析当中才能排除一些技术上的因素，随机误差等，真正的分析出动物怎样的本身性质因素导致了抗体的产生差异。
1.棋盘滴定又称为方阵滴定，即同时将抗原、抗体进行稀释，进行ELISA实验从而确定抗原抗体反应的最佳比例！方阵滴定不太好做，你可以将方阵滴定拆开进行，即先固定抗原，使用不同浓度的抗体，从而确定最佳抗体浓度，然后固定这个抗体浓度，使用不同浓度的抗原，继而确定最佳抗原浓度。当然包被抗原、抗体浓度也有所依据，即抗原一般是1-5ug/ml 、抗体是1-15ug/ml包被。
2.ELISA实验作预试验也是比较重要的，这样可以确定抗原抗体大致的使用量，可以确定酶标抗体的稀释浓度，可以检测实验系统是否正确……你既然做双夹心，可以先固定被检测抗原的浓度，采用不同浓度的包被抗体和不同浓度的检测抗体，确定最佳包被和检测系统。
3. 你要检测血浆中的IL-12和IFN-y，可能会由于红细胞内源性过氧化氢酶而影响实验的敏感性，最好做好正常血浆的对照。
ELISA试剂盒在国内有许多种叫法：例如：ELISA检测试剂盒、ELISA?Kit、酶联免疫试剂盒、酶联免疫吸附测定试剂盒、酶联免疫分析试剂盒、酶免试剂盒等，比较常见的叫法是ELISA检测试剂盒、酶联免疫吸附测定试剂盒等?ELISA试剂盒自从60-70年代问世以来，得到全世界科研工作者的认可及推崇，在欧美及中国获得很大的推广，尤其是国内生化领域的长足发展。Elisa生物试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。本章交流分享：ELISA实验数据处理方法是怎样的？想要了解的同学欢迎来电咨询。
1、拟和曲线：
输入行： 浓度值， 如0 10 50 100
输入第二行：该浓度下的调整后的od值，如0 0.586 1.397 1.997 3.42
选择这些输入的数据，用插入里的图表按钮，进入图表向导，在“标准类型”中选择“xy散点图”；在“子图表类型”中选择“折线散点图”，按“下一步”；选择“系列产生在行”，按“下一步”；数据标志，可以填写：如数据y轴，OD值；数据x轴，浓度；按下一步，点击完成。可得曲线图。
单击曲线，按右键，选择“添加趋势线”，在类型中，选择多项式；在选项中，选择显示公式，选择显示R平方值。
得到公式和R平方值。
也可以用上面说的方法：双击图表，把它输入到图表的数据中，就可以拟和曲线。
2、计算浓度：
次实验：
标准曲线为：
y = -4E-05x2 + 0.026x
R2 = 0.9745
为例，已知OD值，计算浓度。
由于y = -4E-05x2 + 0.026x，所以可以得到：
4E-05x2 －0.026x ＋y＝0
ax2 ＋bx ＋y＝0
a＝4E-05；b＝－0.026；
x＝（－b－（b*b－4ay）（平方根））/(2*a)
代入a，b，和y值，得
x＝（0.026－（0.026*0.026-0.00016*y）(平方根）)/(2*0.00004）
在excel里可以用以下公式表示：
x＝(0.026-EXP(LN(0.026*0.026-0.00016*y)/2))/(2*0.00004)
通用公式为：
x＝（－b－EXP(LN（b*b－4ay）/2)）/(2*a)
应用excel的公式拷贝功能，计算所有浓度
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