elisa实验（elisa实验原理是什么）
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- elisa的原理和实验步骤
- ELISA实验方法
- elisa 实验操作过程中有哪些注意事项
- 医学上ELISA，是什么意思
- ELISA试验要求是什么
ELISA实验原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。
酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色氧化型，出现颜色反应。
因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
ELISA实验步骤及注意事项:
1、固相载体选择
聚苯乙烯：具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。
聚氯乙烯：聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。
良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。
2、包被
①板孔的选择：ELISA级别的微孔板。
②抗体选择：选择支持ELISA实验的抗体，根据推荐浓度稀释或摸索最适浓度。
③包被缓冲液：pH9.6碳酸盐缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲液。
④包被温度：2-8 ℃过夜包被或室温（37℃）包被2h。
⑤包被浓度：包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化。一般包被浓度为10ug/ml-20ug/ml。
3、封闭
①包被之后一定要立即封闭（封闭非特异性抗体）。
②选择效果较好的封闭剂（细胞培养级BSA、Tween等）。
4、加样及孵育
①加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
②孵育的时间及温度参考试剂盒说明书。如有条件，建议加样孵育时使用shaker震荡仪，推荐轨道直径3mm，转速在500±50rpm。
③检测抗体、酶标物的稀释比例、孵育温度、孵育时间严格根据说明书提示。
④洗板对于ELISA来说，是极其关键的一步，保证ELISA的特异性。
⑤封板膜一定要一次一换，切勿二次甚至多次使用，以防交叉污染。
5、显色和终止
①使用前需检查，底物在加入96孔板之前应为无色透明。
②显色底物需现配现用，避免污染。
③孵育时间，说明书上为参考范围，具体需要根据实验条件自行摸索。可参考标曲浓度最大孔的颜色，变为蓝色较明显时即可。
elisa实验原理是由于抗原、抗体的反应在一种固相载体—聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
elisa的实验步骤
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，洗涤。
(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤，后一遍用DDW洗涤。
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
1. ELISA的原理
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
操作步骤:
1．从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压 实自封条，密封口袋，放回4℃。
2．空白孔加标准品和标本稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育90分钟。
3．提前20分钟准备生物素化抗体工作液。
4．洗板5次。
5．空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育60分钟。
6．提前20分钟准备酶结合物工作液。避光室温(22-25 ) ℃ 放置。
7．洗板5次。
8．空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱，避光孵育30分钟。
9．打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。
10．洗板5次。
11．加入显色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分钟。
12．加入终止液100ul/孔, 混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果。
13．实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存至有效期结束。
建议保存酶标板框，以备下次或者今后试验使用。
ELISA法
酶联免疫吸附实验(ELISA) 即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。
elisa实验操作中注意事项:
1.储存.
收到试剂盒后应尽快放入冷藏室内保存,保存温度为4℃-8℃.
2.回温.
试剂盒在使用前应于室温（22-27℃）下充分回温,回温时间为40-60分钟.回温过程中勿将酶标板的包装袋开封,回温结束后再将其从包装袋中取出使用.
3.样品稀释.
样品稀释应严格按照说明书要求的稀释倍数进行稀释.如稀释倍数过大,可采用多步法进行样品稀释.例如：试剂盒要求样品需进行500倍稀释,可吸取5μl样品加入245μl样品稀释液中,充分混匀后,再吸取10μl混合液加入90μl样品稀释液中即可.
4.加样.
稀释好的样品在加入酶标板进行孵育的过程中,尽可能缩短第一次加样和最后一次加样的时间间隔,样品加好后马上开始计时.
5.洗板.
样品孵育时间结束后,马上甩去孔内液体.如多块酶标板需同时洗涤,可先将板内液体甩去,倒扣于吸水纸上,再依次进行洗涤.使用洗板机洗涤时,建议洗涤次数增加一次.未用完的洗涤液可在4℃-8℃下密封保存1月.
6.显色.
底物药片可在显色前3-5分钟加入底物缓冲液中,混合直到完全溶解.本试剂最好是现用现配,未用完的底物溶液可在4℃-8℃下避光保存1周.
7.终止及读数.
提前打开酶标仪,加入终止液后立即读数.
8.同批号试剂盒中的试剂,除酶标二抗及阳性对照外,其余均可通用.
9.移液器的正确使用、保存、清洁、校对.
10.实验室管理
桌面保持整洁,插枪头戴手套等.
酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA）
指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法；酶联免疫吸附测定（ELISA）为免疫学中的经典实验。
基本原理为：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。
扩展资料
结果判断——
1、定性测定：
定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有“或“无“的简单回答，分别用“阳性“、“阴性“表示。“阳性“表示该标本在该测定系统中有反应。“阴性“则为无反应。
2、定量测定：
ELISA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。
参考资料来源：百度百科-ELISA
1 临床标本的收集和保存
用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆）。本实验室用ELISA测定乙肝两对半，甲肝，戊肝，抗HIV的标本时，在处理和保存方面要考虑以下几个方面： 1） 要注意避免出现严重溶血及血清中混有红细胞。当标本出现严重溶血及血清中混有红细胞时，反应孔不易洗净，残留在反应孔内的血红蛋白具有过氧化物酶的活性，显色时可能造成假阳性。 2） 标本凝固不全强行离心，造成血清中含有少量的纤维蛋白原，在实验过程中形成纤维蛋白吸附在反应孔孔壁上不易洗掉，易造成假性结果。 3） 血清标本可在2～8℃下保存1周。如血清样本需长时间保存，则需放入-20℃冰柜内冰冻保存。冰冻保存的血清标本须注意避免反复冻融，标本可能引起假阴性结果。此外冻融标本的混匀不要进行剧烈振荡，应反复颠倒混匀。
2 ELISA 测定中试剂准备
在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再 进行测定，证试剂盒温度要和室温一致。如果把试剂盒从冰箱拿出来直接做实验会造成一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因为在后面的孵育反应步骤中，造成孵育时间不够。其次，ELISA实验中洗板用的洗液需每日更换配制，稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。
3 加血清样本及反应试剂
血清样本使用微量加样枪加样。使用微量加样枪加样必须注意避免以下几点： 1） 加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。需匀速加样，吸样时，加样枪需按到第一档，加样时，加样枪需直接按到底。 2） 加样应直接加入反应孔底部，加在反应孔孔壁上易溅出会对邻近孔产生污染。尽量避免出现气泡。 3） 反应试剂的加入时先要注意试剂的有效期，再注意滴加的角度和滴加的速度。滴加太快易出现重复滴加或加在两孔之间.
4 温育的时间与温度
温育是ELISA测定中最容易出现问题的步骤。温育温度应在37℃，水浴。温育时间应按照试剂说明书上的时间严格执行。温育实际测定操作中要注意以下几点： 1）要保证在设定的温度下有足够的反应时间。温育时间不够，弱阳性样本测不出来 。 2）因为采用水浴，所以在温育时一定要封板，防止水蒸气形成水滴掉入反应孔内造成污染，并有可能整板花板。
5 ELISA测定的洗板
全自动洗板机的使用应注意以下几点： 1） 洗板前，应检查洗液瓶、蒸馏水瓶是否充足，废液瓶是否满瓶。2） 在自检过程中注意观察洗液灌注是否通畅，排液是否通畅。 3） 在洗板过程中，应注意观察反应孔每孔是否灌满且无外溢，每孔吸水是否吸尽，并且要保证洗液在孔中放置的时间。
6 ELISA测定以TMB为底物的显色
加入底物开始显色反应前，最好是先检查一下底物溶液的有效期。滴入A、B显色剂后，需温育15min，最后加入终止液终止反应，振荡混匀后即可进行下面的比色测定判断结果。在此过程中应注意不要把显色剂和终止液滴入顺序弄反，否则重做实验。
7 ELISA的比色测定
ELISA的比色测定由酶标仪进行测定，故需强调比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否是双波长（450nm和630nm）。
8 ELISA测定结果判定
结果判定一般是根据比色结果和肉眼观察综合判定。如在判定过程发现有些反应孔出现倒阴不阳的现象或出现不常见的模式（如乙肝两对半中出现12阳性等），需本着严谨的态度，重新复查。
对ELISA测定中出现问题的可能原因（非试剂盒本身的原因），总结如下： 1)弱阳性质控样本检测不出温育的时间或温度不够；显色反应时间太短；所用配制缓冲液的蒸馏水有问题。
2）测定的重复性差 ，这是由于测定操作引起的问题，包括 ①加样本及试剂量不准；孔间不一致 ②加样过快，孔间发生污染 ③加错样本 ④加样本及试剂时，加在孔壁 ⑤不同批号试剂盒中组分混用 ⑥温育时间、洗板、显色时间不一致 ⑦孔内污染杂物，血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性等。 3）全部孔都不显色 ① 漏加酶结合物； ② 洗板液配制中出现问题 ③ 漏加显色剂A或B ④ 终止剂当显色剂使用 4）全部板孔均有显色 ① 板不干净 ② 显色液变质 ③ 洗板液受酶等污染