ELISA检测HBsAg实验原理
- ELISA检测HBsAg实验原理
- 实验目的怎么写呢
- 实验目的是什么
- ELISA 试验中 阴性 对照的 目的和作用 阳性 对照的 目的和作用 空白的 目的和作用
- 实验的目的是什么
- 如何进行elisa实验的质量控制
- elisa试验中为什么要洗板
- 为什么ELISA反应总是需要一定时间间孵育为什么每步反应后需要洗板
- 什么是Cell-Based ELISA以及应用
- 实验目的怎么写
目的探讨温度、孵育时间、振荡对ELISA法检测HBsAg的影响,以期进一步优化检测条件。方法采用HBsAg含量约为1ng/mL的血清标本,在4种不同条件(37℃振荡、37℃不振荡、25℃室温震荡、25℃室温不振荡)下的3个不同反应时间(10、20、30min)测定HBsAg,记录吸光度值。结果除10min37℃不振荡和25℃不振荡差异无统计学意义(P0.05)外,其余各组差异都有统计学意义(P0.05)。结论
37℃振荡20min为ELISA检测HBsAg的较佳条件。
实验目的写实验所要达到的目标，实验报告是把实验的目的、方法、过程、结果等记录下来，经过整理，写成的书面汇报。科技实验报告是描述、记录某个科研课题过程和结果的一种科技应用文体。
实验报告有下面几项组成：
1、实验目的 说明为什么要做这个实验，以及完成这个实验的重要性。
2、实验内容 实验项目的列表。
3、实验步骤、出现的问题及解决方法 纪录实验中每一个环节，对出现的问题进行描述、分析和尝试解决。
撰写实验报告是科技实验工作不可缺少的重要环节。虽然实验报告与科技论文一样都以文字形式阐明了科学研究的成果，但二者在内容和表达方式上仍有所差别。
科技论文一般是把成功的实验结果作为论证科学观点的根据。实验报告则客观地记录实验的过程和结果，着重告知一项科学事实，不夹带实验者的主观看法。
实验目的：即本次实验所要达到的目标或目的是什么。对某产品的验证和各种假设，设想，理论的正确性，可行性以及找出改良各种各样达到目的的途径。
实验的一方面是验证已有的理论，另一方面是通过合理的实验设计及其实施，证实自己的合理推测并得出相应结论。前者为验证性实验，后者为探索性实验。在实验的过程中，还可以锻炼动手操作能力、利用已有理论解决实际问题的能力等。
实验中遵循的原则
一、对照性原则
1、空白对照：不给对照组任何处理因素。
2、自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。
二、单一变量性原则和等量性原则
实验中要做到单一变量，应注意等量的原则，采用控制变量法。
三、科学性原则
1、明确实验要求和目的，确定实验思路。
2、合理设计操作过程。
3、简明、准确组织语言文字。
阴性对照的目的是排除假阳性，阴性对照就是一个确定肯定已知是阴性的东西，如果结果出来这个样本显示阳性了，那你ELISA就做出问题了。其他未知样本，数值同它一样或者更低的，全部认为是阴性结果。
阳性对照的目的是排除假阴性，阳性对照就是一个确定肯定已知是阳性的东西，如果结果出来这个样本测不出阳性反应，那你ELISA就做出问题了。
空白有的时候可以当作是一种阴性对照。空白的特别意义在于测定实验的背景噪声。也就是说，空白样本被测得到的数值，告诉你未知样本的读数当中，有多少数值是背景，多少是真实特异性的反应所得。
目的：一方面是验证已有的理论。另一方面则是通过合理的实验设计以及其实施，来证实自己的合理推测并得出相应结论。
前者为验证性实验，后者为探索性实验。在实验的过程中，还可以锻炼动手操作能力、利用已有理论解决实际问题的能力等。
著名的实验
1、相传伽利略在比萨斜塔上曾经做过比萨斜塔实验，但后来美国语言与信息研究中心的执行主任凯斯·达维林指出这是一个误传，伽利略并没有做过这项实验。
2、伽利略的斜面滚球实验。
3、拉瓦锡证明空气是由氧气和氮气组成的实验。
4、青蛙实验，在缓慢升高温度的水中的青蛙不会跳出水面而被烫死，这证明了心理学中人若对于环境的不适应程度不明显，危机感将下降的说法。
5、密立根的油滴实验。
6、牛顿的色散实验。
中医大的吧？复制个给你吧，看有没帮助....1.1 基本概念
1.1.1 质量控制（Quaility Control,Q.C）
质量控制是监视全过程，排除误差，防止变化，维持标准化现状的一个管理过程。这
一过程是通过一个反馈环路进行的。
1）确定控制的对象；
2）规定控制对象的标准（预期值）；
3）制定或选择控制方法和手段；
3）测量实际数据；
4）比较或较对实际数据与预期值之间的差异，并说明产生这一差异的原因。超出预
定误差范围，报警系发出信号，反馈通道中断。
5）采取行动，解决差异。恢复原状（原标准状态）的手段发挥作用。
质量控制主要采用质控图进行。质控图是把某一检验的性能数据与所计算出来的预期
的“控制限“进行比较的图。这种性能数据是在按规程正常进行时，按时间顺序而抽选出来
的，其目的是检测检验过程中变异的“可追查“性原因。“可追逆“性的误差原因，是指除去
随机误差以外的其他原因。“控制限“是通过统计计算出来的，在后我们将详细介绍（见
1.3.室内质控程序）。
1.1.2 误差
实验误差分为三种：系统误差、随机误差和过失误差。
系统误差是指一系列测定结果与真值或靶值存在有同一倾向的误差，有明显的规律
性，可在一定条件下重复出现，是可以通过质控预防和校正的。
随机误差又称偶然误差，是一种偶然的、未能预料到的误差，是难以避免和校正的误
差。检验工作中随机误差的分布符合正态分布规律。
过失误差是人为的责任误差。通过加强实验室管理和开展质量控制工作是可以避免
的。
1.1.3 正态分布及标准差
ELISA试验中，检验同一样本达20次以上时，就会发现这组数据（指测定结果的吸光
值）分布在均值两侧，大部分集中在均值附近。如果以测定值为横坐标，以出现的频率为
纵坐标作图，就可绘出一个呈钟形的曲线图。如图5-1，钟顶处为均值，其他值以均值为
中心对称分布，这就是正态分布。
换言之，当ELSIA检测同一样本达一定次数后所得的一组数据，其中靠近均值（X）的
±1SD范围内的数据，占该组数据的68%，在X±2SD范围内分布的数据占总体的95%，
在X±3SD范围内分布的数据占总体的99%。当我们要求检验结果在X±2SD范围内为合格
时，将有95%的数据可能合格。
1.1.4 真值
用确切的、最理想的决定性方法测得的值，称为真值。真值一般是测不到的。通过可
靠的决定性方法测出的值，称为靶值，通常用靶值来表示真值的大小。
1.1.5 准确度（accuracy）
是指测定结果与真值（或靶值）接近的程度。准确度不能以数字表示，往往用不准确
度来衡量。测定结果与靶值的偏离程度称为偏差，它表示该项检验的不准确度。
绝对偏差=检验的均值-真值（或靶值）
相对偏差=绝对偏差真值÷（或靶值）×100%
1.1.6 精密度（Precision）
是指对同一样本重复测定时，每次测定结果与平均值的接近程度，即重复测定值之间
的符合程度。
1.1.7 标准品
1、国际标准品 由WHO或相应组织标定的，用肯定的、公认的、准确的物理或化学方法
测定的定值材料。
2、国际生物学活性标准品根据生物学反应由WHO或相应组织标定的国际活性单位的材
料。
3、参考标准血清 国家标准化组织根据国际标准化生产的法定材料。可用于鉴定仪器和
鉴定方法准确性。
1.1.8 临床决定性水平（clinical decision leuel）
当某个被测物的浓度达到某一水平时，临床医师必须采用医疗措施。被测物的这浓度
称为临床决定性水平。
1.2质量控制血清
质控血清是已有靶值的血清，在每次的常规检验中加入一份或数份，通过所得结果来
了解本次检验的情况。质控血清检验的结果如能控制其误差在一定范围内，就说明该检验
没有发生不允许的误差。如果出现超过允许误差范围的异常结果，提示该检验不合格，应
寻找原因，纠正后，重检待测标本。因此质控血清在质控工作中起重要作用。
1.2.1 质控血清的使用
卫生部临床检验中心制备的乙肝标志物质控血清，可以在-20℃保持半年定值不变。
冰冻状态融化使用时，应先混匀，未用完部分可在4℃保存5天。不宜反复冰融或自行分
装。开展某项检验的室内质控工作需要的质控血清，一般按3-6个月用量准备。自制的不
定值质控血清，在一批质控血清将用完之前，需准备下一批质控血清。质控血清要求性能
稳定，较长期内效价不变，其理化性质应与病人样本相近，这样才能有效地起到监测作
用。
1.2.2 临界值质控血清
质控制血清分定值和未定值两种。如只用一份质控血清定值，一般定在正常值与异常
值交界点上，定性测定时处于弱阳性水平，称为临界值。乙肝标志物临界值的制定，应按
临床要求，为临床提供统一的判断弱阳性的标准。
临界值质控血清可以作为试剂盒中的阳性对照品和阴性对照品以外的第三个对照品，它可
以灵敏地反映出试剂盒的检出水平，确保弱阳性反应的标本不漏检。
1.2.3 质控血清的制备
每个实验室可以根据自己的条件，选用临床中心提供的质控血清，或按以下方法自己制备
本室使用的质控血清（以乙肝质控血清为例）。
1） 收集新鲜的无溶血、无黄疸、无细菌污染的阳性血清。
2） 56℃加热10小时来活。
3） 离心或过滤除去沉淀。
4） 用10%的小牛血清或正常人血清（PBS缓冲液）将收集的血清稀释至所需的浓度。如
能用正常的人血清稀释更好，因其成份更接近于检测标本。
5） 抽滤除菌。按一次使用的量分装小安瓿，封口，20℃保存备用。不可反复冻融。
被检物要求检出的水平常被认为是质控血清应选择的水平。如果该试验还有其它要
求，则应加所要求浓度的质控物。
6） 标定含量。20-30次测定结果删除》±2SD数据的均值作为靶值，并与已知定值血清对
比测定。
1.3 室内质量控制程序
临床检验的检测结果，每次或每天之间不可能没有误差。决定允许的误差范围，以临
床上不造成误诊与漏诊为准，通过以下步骤来确定质控范围。
1） 最佳条件下的测定误差。
2） 已知值的血清在常规检验条件下的误差。
3） 未知值的血清在常规检验条件下的误差。
4） 临床应用的要求。对任何一个试验都应确定一个允许的误差范围，前题是满足临床要
求。如允许误差定得过小，在临床上不存在任何意义，但为了符合该规定却要花费很大人
力、物力和时间。相反，如果将允许误差定得过大，将使监测系统察觉不到临床上要求检
出的误差，失去质控的意义。
1.3.1 最佳条件下已知值质控血清变异（optimal conditions variance,简称OCV）的测定
在本实验室最佳条件下（包括操作者、试剂、仪器等）检测质控血清20-30次，测得
结果计算，求出该组数据的均值和标准差（SD）表示该实验室的最佳工作质量。
现举例说明HBsAg ELISA法检测时OCV的测定。使用的质控制血清为临界血清，
HBsAg浓度为5ng/ml。在该实验室中选择素质最好、操作最熟练的技术员进行认真地专门
测定，选用最佳的试剂盒，检测之前，将恒箱、加样器等认真校正、调校正、调试，使用
新的加样吸头等，即在最佳、最理想的条件下进行检测。除质控血清外同时测定阴性对照
品和阳性对照品。并作双份测定，得出2个吸光值（A值），求出X。连续作20次，求出20
个X，即X1……X20。从这20个数据中，求出OCV的X和SD。
1.3.2常规条件下已知值质控血清变异（routine conditions variance-known value,简称
RCVK）的测定。
做常规检验的技术人员，在常规检验的条件下，将质控血清放在常规检测样本中，进
行20次检验，结果计算同OCV法。一般认为RCV的SD在OCV的SD两倍范围内可以接受。
若太大应该查找原因，使其向OCV的SD值靠近。在改进实验室条件后（例如较正加样
器，纠正洗板操作，调正温育温度等），重新进行RCVK的测定。如果RCVK的SD值更
小，说明OCV不是最佳条件下测定的，应重新再测OCV。常规条件下，RCVK肯定要比
OCV大。通过质控控制各项条件，使RCVK的数据尽可能接近OCV值。RCVK的数据反映
该实验室日常工作的质量，用于作质控图，对室内检验的结果进行控制，每日检验的结
果，报告能否发出。
1.3.3常规条件下,未知值质控血清变异(routine conditions variancl-unknown value 简称
RCVU)的测定
有时为了避免主观性,再作RCVU测定。
测定步骤同RCVK，但检测的操作者不知质控血清的定值，或在操作者不知哪份是质
控血汪清的条件下进行常规检验，以排除操作者的主观性。在此不再举例说明。
1.3.4质控图
通过以上三步骤，可以开始作室内质控图，根据RCVK的和SD作质控框图。利用质控
图可以对每次检验的结果进行监测，当没有更换另一批号试剂盒和另一批号质控血清时，
该质控图可以连续作下去。
质控血清的S/CO值低于-2SD的范围,属“告警“，应寻找原因并在质控图上记录查出的
原因。
ELISA试验中，各种检验项目的误差允许范围均有待在实践中得出结论，以上只是举
例说明质控方法，不是定论。2SD是一般公认的允许误差限度。每批测定放一份质控血清
时，一次超过2SD应作为“告警“，二次超出2SD为“失控“。当质控过程中，出现失控时，出
现失控时，应查找原因，通常是试剂盒或质控血清失效造成。更换试剂盒或更换质控血
清，找出原因纠正后重新检验。如果检验结果仍达不到要求或找不到原 因时，应重复进
行OCV的检验。如果OCV检验的结果仍是好的，说明常规操作出现问题。
一般认为：①一次超出3SD；②连续二次超出2SD；③3-5次连续处于一侧的2SD之内；
④5～7次连续偏向横轴的一侧，均为失控。
第③、④种情况，单独依靠记录往往是不易察觉的，但在质控图上可以清晰地发现这种失
控。
1.3.5统计学计算方法--“即刻性“质控
以上介绍的质控方法基本上与临床化学测定的质控方法相同，但ELISA有其特殊性，
最合适的质控方法尚待研究建立。有些实验室不是每天进行ELISA项目的检验，而ELSIA
试剂盒效期短，用一批号试剂盒连续常规测20次，难度较大。采用“即刻法“质控统计方
法，只需连续测3次，即可对第3次检验结果进行质控。
“即刻法“的建立具体计算方法如下：
1)先将测定值从小到大排列
2)计算X和SD。
3)计算SDI上限和SDI下限值。
4)将SDI上限、SDI下限值与SDI值中的数字比较。当SDI上限值和SDI下限值＜n2SD时，表
示处于控制范围内，可以继续往下测定，继续重复以上各项计算；当SDI上限和SDI下限
有 一值处于n2SD和n2SD值之间时，说明该值在2SD~3SD范围，处于“告警“状态；当
SDI上限和SDI下限有一值＞n2SD时，说明该值已在3SD范围之外，属“失控“。数值处
于“告警“和“失控“状态应舍去，重新测定该项质控血清和病人样本。舍去的只是失控
的这次数值，其他次测定值仍可继续使用。
即刻性质控统计方法，适于ELISA测定的质控。
当检测的数值超过20次以后，不必再使用“即刻法“质控统计计算，可以转入常规的质
控图的质控。将前20次的数值求出的和SD作质控框架图，第21次的数值，依次点入即
可。
1.4室间质量评价（external quality assessment,简称EQA）
室间质量评价简称室间质评，是由质控中心采用一系列的办法连续地、客观地评价各
实验室的试验结果，并发现室内质控不易发现的不准确性，了解各实验室之间结果的差
异，并帮助校正，使具有可比性。各实验室试验结果报到质控中心，经过统计分析，得出
相互比较的结果。这种评价不能控制各实验室每天发出的检验报告，而是一种回顾性评
价。室内质控主要监测试验结果的精密度，而室间质评主要控制试验结果的准确度，不能
互相替代。参与质评的实验室应先做好室内质控。
1.4.1室间质评的方法
1、 发质控物进行调查
这是国内外室间质评的常用形式。部临检中心对乙肝标志物ELISA检验的室间质评采
用定期发放质控物至各实验室，各实验室在规定的日期进行检验，并将检验结果报至部临
检中心。部临检中心经统计分析，将评价结果寄回各实验室。通过评价，各实验室了解本
室工作质量，发现差距，并设法改进，以不断提高检验质量。
这种评价方式有一定缺点，即各实验室常对质控物特殊对待，在检验时选用特殊试剂
盒，选派特别的技术员进行检验，有的实验室互相和对结果并作修改。这就使EQA的结果
不能反映该实验室日常工作水平。
2、 派观察员到实验室进行试剂调查
这种调查事先不通知，临时派观察员到实验室，指定采用常规方法，检验规定的一组
标本，进行评价。
洗涤在 ELISA 过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着实验的成败。ELSIA 就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA 操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。
楼上回答的很好，
ELISA反应的实质是抗原-抗体特异性结合，这需要时间。每次孵育是为了彻底结合，以避免在洗脱的时候与抗原结合的抗体被洗掉。
至于洗板，则是为了避免假阳性，想象一下如果不把没有与抗原结合的抗体洗掉，那实验结果会是什么样子的。
1、Cell-BasedELISA
的优点：
Cell-Based
ELISA（基于细胞的
ELISA）是一种全新的ELISA
技术，有两个最突出的优点：
1.1
不需要抽提蛋白、包被微孔板：细胞直接在微孔板里培养，待检测的时候，将细胞固定在微孔板上并
进行通透处理即可。这样就避免了抽提蛋白时，由于客观和主观上引起样品的损失而导致实验结果在一定
程度上偏离了实际情况。同时不用包被微孔板，简化了实验流程，有助于提高效率。科研人员在一个
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酶联板上，便能检测目标细胞蛋白经刺激或抑制作用后的表现。由于省去抽提蛋白和裂解细胞的步骤，样本的损失也能降到最低，比起其他普通的
ELISA
测定方法，这项全新的
ELISA
技术能更快速、更方便
地一次检测大量的细胞内蛋白。
1.2
可同时检测两种不同蛋白：封闭后加入两种抗不同蛋白且来源于不同宿主的一抗，然后再加入不同的
二抗，加入两种荧光底物，检测两个波长。同时检测两种蛋白的好处是显而易见的，可以减少工作量，此
外还可以满足一些特殊的实验需要，例如，需要测定某个蛋白的磷酸化比例，就需要测定磷酸化蛋白的数
量和总蛋白的数量，这两个测定在同一次实验进行，有助于消除实验误差，得到更为精确的实验结果。
2、Cell-Based
ELISA
的两种技术：
某些公司发展了双通道Cell-Based
ELISA
技术；
双通道与单通道Cell-based
ELISA
比较：
双通道cell-based
ELISA，顾名思义，即一次可以同时检测两种目的蛋白，R&D
Systems
提供的
Cell-based
ELISA
就是双通道cell-based
ELISA，原理略：（需要荧光检测方式和相应仪器）；
单通道cell-based
ELISA，即一次只能检测一种目的蛋白，他和普通ELISA
的主要区别在于样品处理过
3、cell-basedELISA
的应用：
该产品，最多发展起来的是用于检测磷酸化和非磷酸化蛋白的相对含量；
4、有cell-based
ELISA
产品的公司：目前，多家elisa
产品提供
提供cellbased
elisa
试剂盒，如Rnd
systems，
raybiotech，
ebioscience，
millipore
等公司；
5、如何自己进行
cell
based
elisa
实验？
事实上，根据单通道的cell
based
elisa
原理，可以自己建立cell
based
elisa
实验系统；
细胞加入培养板中；
加入刺激物或者抑制剂进行培养；
对细胞进行固定或者封闭；
加入第一抗体；
加入HRP
结合的二抗（二抗的选择，同western
blot）；
加入底物进行显色；
写作思路及要点：围绕实验本身，目的要明确，在理论上验证定理、公式、算法，并使实验者获得深刻和系统的理解，在实践上，掌握使用实验设备的技能技巧和程序的调试方法。一般需说明是验证型实验还是设计型实验，是创新型实验还是综合型实验。保持一定真实性。
正文：
实验目的：
1、使得学生把课本所学专业基础知识和专业知识与实践相结合。
2、巩固专业理论教学的效果，培养学生调查、研究、观察问题的能力。
3、使得学生更好地了解社会、了解将来可能从事的行业，为将来更快的适应工作打下基础。
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